禽傳染性支氣管炎病毒(AIBV)熒光PCR試劑盒說明書
【產品名稱】
商品名稱：禽傳染性支氣管炎病毒(AIBV)核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)
Name ：Diagnostic Kit for Avian Infectious Bronchitis Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于檢測的氣管滲出物、支氣管和肺組織、腎臟或輸卵管等標本中
禽傳染性支氣管炎病毒RNA，適用于禽傳染性支氣管炎病毒感染的輔助診斷。其檢
測結果僅供參考。
【檢驗原理】
本試劑盒用一對禽傳染性支氣管炎病毒特異性引物，結合一條特異性熒光探針，
用一步法熒光RT-PCR技術對禽傳染性支氣管炎病毒RNA進行體外擴增檢測，用
于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μl×1 管
AIBV 反應液 1.0ml×1 管
AIBV 陽性質控品 50μl ×1 管
陰性質控品 250μl ×1 管
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，
有效期 12 個月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。
【標本采集】
對于急性呼吸道型的病禽，應采取氣管滲出物；對于剛撲殺的病禽，采取支氣管
和肺組織；對于腎型和產蛋下降型的病禽，應采取發(fā)病雞的腎臟或輸卵管。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標
本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.05g 于
研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管
中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取
法)，請按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性
對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 AIBV 反應液 酶液
用量 20μl 1μl
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μl，分別加入相應的反
應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；
4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇：
檢測通道(Reporter Dye)FAM， 淬滅通道(Quencher Dye)NONE，請勿
選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數設置：
步驟 循環(huán)數 溫度 時間 收集熒光信號
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle
94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5. 結果分析判定
5.1結果分析條件設定
設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲
線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15
范圍內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value
值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2結果判斷
陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線；
可疑：檢測通道 35.0
值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測結果 Ct 值>37 或無 Ct 值。
7. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 產品性能指標
陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100%；10 份陰性參考品符合率
為 100%。
低檢測限：5.0×102copies/ml。
精密度：批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(CV)均小于等于 3%。
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